I ricercatori dell'Università Rockefeller hanno ridisegnato con successo una piattaforma di microscopia a tre fotoni per catturare l'attività neuronale nelle regioni profonde del cervello di topi vivi. Guidati da Alipasha Vaziri, PhD, capo del Laboratorio di Neurotecnologia e Biofisica, il team ha sviluppato un sistema noto come Three-photon Ultra-Deep Imaging (TrUDI). Questo avanzamento permette di registrare l'attività delle popolazioni neurali a profondità di circa 2 mm senza la necessità di rimuovere chirurgicamente la corteccia che tipicamente oscura le strutture più profonde.
Lo studio, intitolato "Cellular-resolution three-photon ultra-deep imaging (TrUDI) of neuronal population activity at 2-mm depth in the mammalian brain", è stato pubblicato su Nature Methods. Ottimizzando i parametri laser, ottici e di acquisizione, la nuova piattaforma genera circa 250 volte più fotoni di fluorescenza rilevati alla stessa potenza del laser rispetto agli approcci precedenti. Questo significativo aumento del segnale abilita registrazioni con risoluzione cellulare che in precedenza erano irraggiungibili a tali profondità.
Vaziri ha spiegato che il team ha adottato un "approccio da zero" invece di attenersi ai limiti storici riguardanti laser specifici o parametri. Sebbene la microscopia a tre fotoni produca intrinsecamente meno fluorescenza di fondo rispetto ai metodi a due fotoni, raggiungere una profondità del segnale sufficiente richiede impulsi laser energetici che rischiano di riscaldare e danneggiare i tessuti se la potenza media viene aumentata indiscriminatamente. Le precedenti registrazioni funzionali utilizzando questa tecnica avevano raggiunto solo circa 1,2 mm, rimanendo al di sotto del limite teorico di oltre 2 mm.
Per superare queste barriere, i ricercatori hanno utilizzato modelli informatici per guidare cambiamenti coordinati nel laser e nell'ottica. Il sistema TrUDI allinea i parametri del laser di eccitazione, il sistema ottico e le impostazioni di acquisizione sia ai limiti lineari che non lineari per un'esposizione laser sicura, soddisfacendo al contempo i requisiti spaziotemporali per l'imaging del calcio con risoluzione cellulare. Inoltre, il team ha sviluppato uno schema di eccitazione mirato ai neuroni che attiva il laser solo durante la scansione delle cellule identificate.
Queste ottimizzazioni sistematiche hanno aumentato il segnale di fluorescenza disponibile per registrare l'attività transitoria nei singoli neuroni. I test condotti sui topi hanno dimostrato registrazioni su campi visivi di circa 230 per 230 µm² a una frequenza di 8,6 Hz, raggiungendo con successo profondità di circa 2 mm nella corteccia e nell'ippocampo del topo. Questo progresso amplia l'accesso ai circuiti neurali che in precedenza richiedevano la rimozione invasiva dei tessuti per l'imaging ottico.
Nonostante questa svolta, Vaziri ha notato che non tutte le strutture profonde del cervello sono ora accessibili. Alcune regioni dello striato rimangono irraggiungibili e diversi nuclei cerebrali profondi situati ancora più in profondità richiedono ancora approcci invasivi. Il lavoro dimostra principalmente come l'ottimizzazione coordinata possa avvicinare l'imaging a tre fotoni al suo limite di profondità fondamentale preservando al contempo l'integrità dei tessuti sopra le regioni studiate.