Forscher der Rockefeller University haben erfolgreich eine Plattform für die Drei-Photonen-Mikroskopie neu konzipiert, um neuronale Aktivität in tiefen Hirnregionen lebender Mäuse aufzuzeichnen. Unter der Leitung von Alipasha Vaziri, PhD, Leiter des Laboratoriums für Neurotechnologie und Biophysik, entwickelte das Team ein System, das als Three-photon Ultra-Deep Imaging (TrUDI) bekannt ist. Diese Weiterentwicklung ermöglicht die Aufzeichnung der Aktivität neuronaler Populationen in Tiefen von etwa 2 mm, ohne dass es notwendig ist, den Kortex chirurgisch zu entfernen, der normalerweise tiefere Strukturen verdeckt.
Die Studie mit dem Titel "Cellular-resolution three-photon ultra-deep imaging (TrUDI) of neuronal population activity at 2-mm depth in the mammalian brain" wurde in Nature Methods veröffentlicht. Durch die Optimierung von Laser-, optischen und Erfassungsparametern erzeugt die neue Plattform bei gleicher Laserleistung etwa 250-mal mehr detektierte Fluoreszenzphotonen als frühere Ansätze. Diese signifikante Signalsteigerung ermöglicht Aufzeichnungen mit Einzelzellauflösung, die in solchen Tiefen zuvor nicht erreichbar waren.
Vaziri erklärte, dass das Team einen Ansatz mit einem "sauberen Blatt Papier" gewählt habe, anstatt sich an historische Einschränkungen bezüglich spezifischer Laser oder Parameter zu halten. Während die Drei-Photonen-Mikroskopie von Natur aus weniger Hintergrundfluoreszenz erzeugt als Zwei-Photonen-Methoden, erfordert das Erreichen einer ausreichenden Signaltiefe energiereiche Laserpulse, die bei willkürlicher Erhöhung der Durchschnittsleistung das Gewebe erhitzen und schädigen können. Bisherige funktionelle Aufzeichnungen mit dieser Technik hatten nur Tiefen von etwa 1,2 mm erreicht und verfehlten damit die theoretische Grenze von mehr als 2 mm.
Um diese Barrieren zu überwinden, nutzten die Forscher Computermodelle, um koordinierte Änderungen am Laser und an der Optik vorzunehmen. Das TrUDI-System stimmt die Parameter des Anregungslasers, das optische System und die Erfassungseinstellungen sowohl mit linearen als auch nichtlinearen Grenzen für eine sichere Laserexposition ab, während gleichzeitig die raumzeitlichen Anforderungen für die Kalziumbildgebung mit Einzelzellauflösung erfüllt werden. Darüber hinaus entwickelte das Team ein auf Neuronen zielgerichtetes Anregungsschema, bei dem der Laser nur dann aktiviert wird, wenn identifizierte Zellen gescannt werden.
Diese systematischen Optimierungen erhöhten das verfügbare Fluoreszenzsignal zur Aufzeichnung transienter Aktivität in einzelnen Neuronen. Tests an Mäusen zeigten Aufzeichnungen über Gesichtsfelder von etwa 230 mal 230 µm² mit einer Rate von 8,6 Hz und erreichten erfolgreich Tiefen von etwa 2 mm in den Kortex und Hippocampus der Maus. Dieser Fortschritt erweitert den Zugang zu neuronalen Schaltkreisen, für die zuvor eine invasive Entfernung von Gewebe für die optische Bildgebung erforderlich war.
Trotz dieses Durchbruchs stellte Vaziri fest, dass nicht jede tiefe Hirnstruktur nun zugänglich ist. Bestimmte Bereiche des Striatums bleiben unerreichbar, und mehrere tief im Gehirn gelegene Kerne erfordern nach wie vor invasive Ansätze. Die Arbeit demonstriert in erster Linie, wie eine koordinierte Optimierung die Drei-Photonen-Bildgebung näher an ihre fundamentale Tiefengrenze bringen kann, während die Integrität des Gewebes oberhalb der untersuchten Regionen erhalten bleibt.