Los investigadores de la Universidad Rockefeller han rediseñado con éxito una plataforma de microscopía de tres fotones para capturar la actividad neuronal en regiones profundas del cerebro de ratones vivos. Liderado por Alipasha Vaziri, PhD, jefe del Laboratorio de Neurotecnología y Biofísica, el equipo desarrolló un sistema conocido como Imagen Ultra Profunda de Tres Fotones (TrUDI). Este avance permite registrar la actividad de poblaciones neuronales a profundidades de aproximadamente 2 mm sin necesidad de extirpar quirúrgicamente la corteza que típicamente oscurece las estructuras más profundas.
El estudio, titulado "Imagen ultra profunda de tres fotones con resolución celular (TrUDI) de la actividad de poblaciones neuronales a una profundidad de 2 mm en el cerebro de mamíferos", fue publicado en Nature Methods. Al optimizar los parámetros láser, ópticos y de adquisición, la nueva plataforma genera aproximadamente 250 veces más fotones de fluorescencia detectados con la misma potencia láser en comparación con enfoques anteriores. Este aumento significativo en la señal permite registros con resolución de célula única que anteriormente eran inalcanzables a tales profundidades.
Vaziri explicó que el equipo adoptó un "enfoque de pizarra limpia" en lugar de adherirse a limitaciones históricas respecto a láseres específicos o parámetros. Si bien la microscopía de tres fotones produce inherentemente menos fluorescencia de fondo que los métodos de dos fotones, lograr una profundidad de señal suficiente requiere pulsos láser energéticos que corren el riesgo de calentar y dañar el tejido si se aumenta la potencia promedio indiscriminadamente. Los registros funcionales anteriores utilizando esta técnica solo habían alcanzado aproximadamente 1,2 mm, quedándose cortos del límite teórico de más de 2 mm.
Para superar estas barreras, los investigadores utilizaron modelos informáticos para guiar cambios coordinados en el láser y la óptica. El sistema TrUDI ajusta los parámetros del láser de excitación, el sistema óptico y la configuración de adquisición tanto a los límites lineales como no lineales para una exposición láser segura, al tiempo que cumple con los requisitos espaciotemporales para la imagen de calcio con resolución de célula única. Además, el equipo desarrolló un esquema de excitación dirigido a neuronas que activa el láser solo cuando se escanean células identificadas.
Estas optimizaciones sistemáticas aumentaron la señal de fluorescencia disponible para registrar la actividad transitoria en neuronas individuales. Las pruebas realizadas en ratones demostraron registros sobre campos de visión de aproximadamente 230 por 230 µm² a una tasa de 8,6 Hz, alcanzando con éxito profundidades de unos 2 mm dentro de la corteza y el hipocampo del ratón. Este progreso amplía el acceso a circuitos neuronales que anteriormente requerían la extirpación invasiva de tejido para la imagen óptica.
A pesar de este avance, Vaziri señaló que no todas las estructuras profundas del cerebro son ahora accesibles. Ciertas regiones del estriado permanecen fuera de alcance, y varios núcleos profundos del cerebro ubicados aún más profundamente siguen requiriendo enfoques invasivos. El trabajo demuestra principalmente cómo la optimización coordinada puede acercar la imagen de tres fotones a su límite fundamental de profundidad mientras preserva la integridad del tejido por encima de las regiones estudiadas.